[分享]市售菌種菌相測試結果

Peterliu0801 說：
有實驗跟文章還是讚啊～
反正在這個資訊爆炸的年代，要怎麼萃取精華跟納為己用本來就是現代人需要學習的。

之前會懷疑主要是離心的方式應該都把東西旋死了，裡面除了DNA應該還會包含一些副產物吧。
按一下展開……
抽取DNA的過程本來就要把細胞打破，所以死活其實根本沒差，不用像取活菌那樣還要特別小心離心不能傷到菌。

而抽DNA的目的基本上就是要盡量去除樣本裡DNA以外的東西。
目前我這邊做完的步驟是先用市售的extraction kit來沉澱以及吸附掉蛋白質等雜質進行初步的純化，然後用UV測吸光度量濃度和純度。
接下來我會再把這些DNA做PCR擴增要進行定序的片段後拿去跑膠體電泳做第二次純化。
電泳的原理是把DNA打到洋菜膠體裡後通電，然後靠DNA帶負電的特性分離不同長度的片段(越長往正極跑得越慢)，最終把目標片段從洋菜膠中切出來就完成純化了。
這樣的膠體純化會進行兩次，同時中間會再幫每個樣本的DNA裝上不同的辨識用序列(分析定序結果時才認得出該DNA屬於哪個樣本)，最終的成品就可以準備送去定序公司了。
 
jeremie 說：
抽取DNA的過程本來就要把細胞打破，所以死活其實根本沒差，不用像取活菌那樣還要特別小心離心不能傷到菌。

而抽DNA的目的基本上就是要盡量去除樣本裡DNA以外的東西。
目前我這邊做完的步驟是先用市售的extraction kit來沉澱以及吸附掉蛋白質等雜質進行初步的純化，然後用UV測吸光度量濃度和純度。
接下來我會再把這些DNA做PCR擴增要進行定序的片段後拿去跑膠體電泳做第二次純化。
電泳的原理是把DNA打到洋菜膠體裡後通電，然後靠DNA帶負電的特性分離不同長度的片段(越長往正極跑得越慢)，最終把目標片段從洋菜膠中切出來就完成純化了。
這樣的膠體純化會進行兩次，同時中間會再幫每個樣本的DNA裝上不同的辨識用序列(分析定序結果時才認得出該DNA屬於哪個樣本)，最終的成品就可以準備送去定序公司了。
按一下展開……
大概大概了解啊～
簡單說就是要加入變性劑？還什麼的去分層取出DNA, 再切成片段去定序。（印象中一次性能讀取的長度一直有在進步？）
但這種DNA 純化方法據我所知的產生出來的副產物本來就也會比較多。（脂質、蛋白質等等等）
畢竟後續還會再加工才去定序。

回歸主題：
感覺用這個DNA萃取菌種大小觀察菌數可能誤差會比較大～
若要看菌數占比（%），也許正規的方式比較好？
這麼純的學術討論也是蠻有趣的。看能不能從中歸納出方法。不然現在也是處在一個好用繼續用的階段。也不知道作用上是怎麼作用。個廠牌間擅長的部分是什麼及各種優缺點。真希望有開天眼的那一天～
 
Peterliu0801 說：
大概大概了解啊～
簡單說就是要加入變性劑？還什麼的去分層取出DNA, 再切成片段去定序。（印象中一次性能讀取的長度一直有在進步？）
但這種DNA 純化方法據我所知的產生出來的副產物本來就也會比較多。（脂質、蛋白質等等等）
畢竟後續還會再加工才去定序。
按一下展開……
基本上除了定序本身是花錢給別人做外其他的樣本前處理都是我們實驗室內會自己弄。

做菌相分析的樣本處理流程簡化後大概是這樣：
1. 初步萃取DNA(主要靠鹽類和酒精洗掉其他東西)
2. PCR把萃取完的DNA中目標片段擴增
3. 跑電泳分離PCR產物後切膠純化(到這裏基本上已經不太會有DNA外的東西了)
4. 再次透過PCR擴增上一步產物順便裝上辨識用的序列
5. 再跑電泳切膠純化一次

如果是要分析菌相的話通常只會看16S rRNA 的DNA片段，所以PCR擴增的就是這區，至於其他DNA就會在切膠純化時分離掉，最終交給定序公司的就是一堆乾淨的16S序列讓他們來讀。
16S是原核生物共有的基因，雖然結構差不多但序列的變異性又足夠用來區分不同微生物，因此有很充足的資料庫可以比對定序出來的東西到底是啥。

Peterliu0801 說：
感覺用這個DNA萃取菌種大小觀察菌數可能誤差會比較大～
若要看菌數占比（%），也許正規的方式比較好？
這麼純的學術討論也是蠻有趣的。看能不能從中歸納出方法。不然現在也是處在一個好用繼續用的階段。也不知道作用上是怎麼作用。個廠牌間擅長的部分是什麼及各種優缺點。真希望有開天眼的那一天～
按一下展開……
如果單純只是抽出來濃度差很多的話我大概也不會想太多，畢竟會造成萃取結果不同的原因還有很多。但這次連菌塊大小靠肉眼就已經看得出明顯差異了，其DNA濃度差我自然也會認為大概率是源自於根本上的菌量不同。

真的要靠分子生物技術定量的話還有個方法是qPCR(就是之前疫情時新聞常出現那個)，只是我們這裡沒有設備就是了。
不過我的目標還是先以菌相為主，至少看看裡頭到底理應是些什麼東西吧。
 
最後編輯：
身為水產養殖系畢業 玩珊瑚又從事水產養殖業的我來看
我相信生命科學相關畢業的人都很清楚
微生物操作是一件非常嚴謹的事情
培養及操作都是需要在無菌操作台去避免受到汙染
所以面對市售液體水族用菌
我都頗嗤之以鼻，在富含營養的培養夜裏面添加各式活菌，要如何避免汙染?
還有要如何保證在有效期限內不讓保持菌株數的平衡?
但為何在水產養殖用菌上幾乎90%都是以菌粉模式去銷售
為的就是減少菌汙染的狀況且更加安全
最後kz系統就是以異營菌控Np系統
類似於水產養殖的biofloc 系統，我們會在水中添加砂糖或是糖蜜以增加異營菌的數量
進而減少飼料所產生的含氮廢棄物，
靠硝化菌的系統通常效率不佳。
 
macintosh612 說：
身為水產養殖系畢業 玩珊瑚又從事水產養殖業的我來看
我相信生命科學相關畢業的人都很清楚
微生物操作是一件非常嚴謹的事情
培養及操作都是需要在無菌操作台去避免受到汙染
所以面對市售液體水族用菌
我都頗嗤之以鼻，在富含營養的培養夜裏面添加各式活菌，要如何避免汙染?
按一下展開……
然而水產養殖跟海水缸, 特別是養珊瑚的缸子還是有很大區別的.
水產養殖的那些菌粉.(枯草菌阿等等等, 而且味道也不好聞) 沒辦法把營養鹽的level降到足夠低.
所以我覺得是沒辦法概括而論啦~水產養殖只是把水質調整到可以養水產的等級.
不然我相信大家都拿水產養殖的菌來開缸就好了啊 一袋沒多少錢~省錢又厲害的話, 市面上這些品牌菌不就不用玩了.
不過你是專家的話可以來釋疑一下.
macintosh612 說：
還有要如何保證在有效期限內不讓保持菌株數的平衡?
但為何在水產養殖用菌上幾乎90%都是以菌粉模式去銷售
為的就是減少菌汙染的狀況且更加安全
按一下展開……
菌粉沒記錯8.4有舊的文章討論過. 相對效果應該是更差的.(對珊瑚缸來說, np跟營養鹽較要求的情況)
有用的還是異營菌阿. 所以才要一直補.(沒辦法長久生存)
macintosh612 說：
最後kz系統就是以異營菌控Np系統
按一下展開……
認同, 如上所說其實市面上應該都是異營菌吧. 才能有效控制NP. 過外論壇很多都有討論到.
macintosh612 說：
類似於水產養殖的biofloc 系統，我們會在水中添加砂糖或是糖蜜以增加異營菌的數量
進而減少飼料所產生的含氮廢棄物，
靠硝化菌的系統通常效率不佳。
按一下展開……
 
Peterliu0801 說：
然而水產養殖跟海水缸, 特別是養珊瑚的缸子還是有很大區別的.
水產養殖的那些菌粉.(枯草菌阿等等等, 而且味道也不好聞) 沒辦法把營養鹽的level降到足夠低.
所以我覺得是沒辦法概括而論啦~水產養殖只是把水質調整到可以養水產的等級.
不然我相信大家都拿水產養殖的菌來開缸就好了啊 一袋沒多少錢~省錢又厲害的話, 市面上這些品牌菌不就不用玩了.
按一下展開……
如果單純只是想降營養鹽到ULNS的程度的話我倒不認為需要什麼特殊的菌株，畢竟單靠碳源基本上也足以把營養鹽處理到見底了。
枯草桿菌(Bacillus subtilis)同樣也不是水產養殖專用的，很多水族用菌同樣也會用他(如一開始那篇有測試的MB7和Eco-balance)，因為這東西相對算是比較好商品化的菌，研究也夠多(B. subtilis可以說是目前我們最了解的革蘭氏陽性菌)。
至於市售的水產養殖用菌種產品到底和養珊瑚用的有什麼根本上差異我就不曉得了，畢竟也鮮少水族廠商有提供任何相關研究或實驗資料。

Peterliu0801 說：
菌粉沒記錯8.4有舊的文章討論過. 相對效果應該是更差的.(對珊瑚缸來說, np跟營養鹽較要求的情況)
有用的還是異營菌阿. 所以才要一直補.(沒辦法長久生存)
按一下展開……
絕大多數關於菌粉的國內討論應該都是針對“硝化菌”產品而非與碳源配合用來控制營養鹽的其他異營菌產品。
會有菌粉效果差這個結論的其中一個原因是正宗的自營硝化菌由於沒有形成芽苞的能力且冷凍乾燥存活率也不高所以幾乎無法製成乾燥保存的產品，但像是Bacillus spp.就沒這問題。
不過市售的水族產品中的確比較少見到與有機碳源搭配處理營養鹽的粉狀菌種產品，目前我想得到的也就AF的Pro Bio F和益生菌鹽吧。

而這些菌種到底有沒有必要持續補充這點我也沒看過任何證據可以支持。
不然我至少也想看看到底照著說明書添加量往缸內加這些市售菌種產品能對整體菌相以及系統建立造成多大的影響。
 
最後編輯：
macintosh612 說：
在富含營養的培養夜裏面添加各式活菌，要如何避免汙染?
還有要如何保證在有效期限內不讓保持菌株數的平衡?
按一下展開……
這也是我很好奇的點
Timothy A. Hovanec (Dr. Tim老闆)之前在論壇上是有提過他們的產品是透過生長抑制劑來避免細菌在瓶中亂長，然後等加到缸內抑制劑濃度被稀釋後目標菌株才會開始增殖。
不過到底是什麼樣的生長抑制劑就不曉得了，也許是比較高濃度的鹽類緩衝液或是有機溶劑。
只是一般實驗室內的長期菌種保存確實還是會放冷凍，除了停止細胞活動外也是為了盡量避免污染。
 
jeremie 說：
如果單純只是想降營養鹽到ULNS的程度的話我倒不認為需要什麼特殊的菌株，畢竟單靠碳源基本上也足以把營養鹽處理到見底了。
枯草桿菌(Bacillus subtilis)同樣也不是水產養殖專用的，很多水族用菌同樣也會用他(如一開始那篇有測試的MB7和Eco-balance)，因為這東西相對算是比較好商品化的菌，研究也夠多(B. subtilis可以說是目前我們最了解的革蘭氏陽性菌)。
至於市售的水產養殖用菌種產品到底和養珊瑚用的有什麼根本上差異我就不曉得了，畢竟也鮮少水族廠商有提供任何相關研究或實驗資料。


絕大多數關於菌粉的國內討論應該都是針對“硝化菌”產品而非與碳源配合用來控制營養鹽的其他異營菌產品。
按一下展開……
我個人是覺得大部分液態的都是異營菌比較多吧。
jeremie 說：
會有菌粉效果差這個結論的其中一個原因是正宗的自營硝化菌由於沒有形成芽苞的能力且冷凍乾燥存活率也不高所以幾乎無法製成乾燥保存的產品，但像是Bacillus spp.就沒這問題。
不過市售的水族產品中的確比較少見到與有機碳源搭配處理營養鹽的粉狀菌種產品，目前我想得到的也就AF的Pro Bio F和益生菌鹽吧。

而這些菌種到底有沒有必要持續補充這點我也沒看過任何證據可以支持。
按一下展開……
都只能用每個人的操作經驗來看
然後大大的因人而異🤣
期待誰能出來給個合理且又能說服大家的理論囉
jeremie 說：
不然我至少也想看看到底照著說明書添加量往缸內加這些市售菌種產品能對整體菌相以及系統建立造成多大的影響。
按一下展開……
我自己的經驗是開缸肯定比較快啦
而且操作上降np, 處理缸況也有一定助益。
當然以上只能用感覺的。
畢竟沒有對照組。
（也有人覺得沒用，推行的不用加菌的）
 
我也不知道加菌有沒有用，
但是最近回家，一開門進屋，
會聞到推薦我用fm硝化菌的那間水族館的味道，
之前家裏沒這味道，
我以前去那間水族館，一直覺得他們店裡味道很特別，
但是直到最近在自己家裡聞到，才恍然大悟原來是菌散發出來的啊！🤔

jeremie 說：
如果單純只是想降營養鹽到ULNS的程度的話我倒不認為需要什麼特殊的菌株，畢竟單靠碳源基本上也足以把營養鹽處理到見底了。
枯草桿菌(Bacillus subtilis)同樣也不是水產養殖專用的，很多水族用菌同樣也會用他(如一開始那篇有測試的MB7和Eco-balance)，因為這東西相對算是比較好商品化的菌，研究也夠多(B. subtilis可以說是目前我們最了解的革蘭氏陽性菌)。
至於市售的水產養殖用菌種產品到底和養珊瑚用的有什麼根本上差異我就不曉得了，畢竟也鮮少水族廠商有提供任何相關研究或實驗資料。


絕大多數關於菌粉的國內討論應該都是針對“硝化菌”產品而非與碳源配合用來控制營養鹽的其他異營菌產品。
會有菌粉效果差這個結論的其中一個原因是正宗的自營硝化菌由於沒有形成芽苞的能力且冷凍乾燥存活率也不高所以幾乎無法製成乾燥保存的產品，但像是Bacillus spp.就沒這問題。
不過市售的水族產品中的確比較少見到與有機碳源搭配處理營養鹽的粉狀菌種產品，目前我想得到的也就AF的Pro Bio F和益生菌鹽吧。

而這些菌種到底有沒有必要持續補充這點我也沒看過任何證據可以支持。
不然我至少也想看看到底照著說明書添加量往缸內加這些市售菌種產品能對整體菌相以及系統建立造成多大的影響。
按一下展開……
我知道這隻枯草桿菌，😲
TM蝦菌就是這隻對吧？
有些魚友實測加下去可以清除缸中怪藻怪菌，
不過可能我以前的小缸過濾系統太弱，加上第一次跳海，蠢蠢的用3～4公分的美矽沙當底床，
累積太多營養鹽，所以這隻菌的效果不太明顯，依然鼻涕肆虐，基本還是靠大量換水，
那除了枯草桿菌以外，魚缸裡比較有名的益生菌還有哪些呀？酵母嗎？
我努力的看了這篇文，好難呀！
看完以後得到了頭痛～～～🫠
 
Peterliu0801 說：
我自己的經驗是開缸肯定比較快啦
而且操作上降np, 處理缸況也有一定助益。
當然以上只能用感覺的。
畢竟沒有對照組。
（也有人覺得沒用，推行的不用加菌的）
按一下展開……
這我過年後應該是可以設計個實驗測試看看。
雖然空間是不太夠設多個重複組，不過基本的實驗組和對照組還是會有。
我目前的規劃是先照KZ說明開個兩缸，一缸加bak一缸不加，然後將初始海水營養鹽濃度調到一致後追蹤其走勢，最終再測試兩缸菌相。

exit70 說：
我也不知道加菌有沒有用，
但是最近回家，一開門進屋，
會聞到推薦我用fm硝化菌的那間水族館的味道，
之前家裏沒這味道，
我以前去那間水族館，一直覺得他們店裡味道很特別，
但是直到最近在自己家裡聞到，才恍然大悟原來是菌散發出來的啊！🤔
按一下展開……
這倒是個蠻有趣的現象。
除了缸子外，菌種產品的內容物也有類似的味道嗎？

exit70 說：
我知道這隻枯草桿菌，😲
TM蝦菌就是這隻對吧？
有些魚友實測加下去可以清除缸中怪藻怪菌，
不過可能我以前的小缸過濾系統太弱，加上第一次跳海，蠢蠢的用3～4公分的美矽沙當底床，
累積太多營養鹽，所以這隻菌的效果不太明顯，依然鼻涕肆虐，基本還是靠大量換水，
那除了枯草桿菌以外，魚缸裡比較有名的益生菌還有哪些呀？酵母嗎？
我努力的看了這篇文，好難呀！
看完以後得到了頭痛～～～🫠
按一下展開……
TM確實有明文標示產品裡頭有含Bacillus subtilis。
除了芽苞桿菌屬(Bacillus)的菌外，紫非硫菌系列的光合菌如Rhodopseudomonas或Rhodospirillum也很常見於市售水族菌種產品，且同樣亦有水產養殖方面的應用。

至於酵母的話雖然確實有些人會用來餵食珊瑚或其他濾食生物，但水質處理方面就比較少資料了。不過我也的確看過幾款市售產品宣稱有包含酵母。
 
jeremie 說：
這我過年後應該是可以設計個實驗測試看看。
雖然空間是不太夠設多個重複組，不過基本的實驗組和對照組還是會有。
我目前的規劃是先照KZ說明開個兩缸，一缸加bak一缸不加，然後將初始海水營養鹽濃度調到一致後追蹤其走勢，最終再測試兩缸菌相。
按一下展開……
但這要怎麼測…感覺超難的啊…
鹽養鹽跟菌相這兩個怎麼測量啊。

而且照kz 14天開缸法其實條件很嚴苛耶。
99%現在說kz 開缸的只是用他的菌而已，其他條件幾乎都不成立🤣

貼給你看
www.korallen-zucht.de

Initial cycle - just 14 days? | korallen-zucht.de

www.korallen-zucht.de www.korallen-zucht.de
好文可以收藏🤣，我覺得可以知道蠻多東西的。
但條件很嚴苛需要大量活石。
還有沸石，他的沙等等等….
當然這是要嚴謹的話啦。

這也是我前面回覆說的，這些大廠商其實都有很大量開缸成功的實驗經驗。你全部照做基本上一定可以成功開缸。
所以我會覺得這些廠商一定有一些他們的know how。

jeremie 說：
這倒是個蠻有趣的現象。
除了缸子外，菌種產品的內容物也有類似的味道嗎？
按一下展開……
枯草君很臭啊🤣
jeremie 說：
TM確實有明文標示產品裡頭有含Bacillus subtilis。
除了芽苞桿菌屬(Bacillus)的菌外，紫非硫菌系列的光合菌如Rhodopseudomonas或Rhodospirillum也很常見於市售水族菌種產品，且同樣亦有水產養殖方面的應用。

至於酵母的話雖然確實有些人會用來餵食珊瑚或其他濾食生物，但水質處理方面就比較少資料了。不過我也的確看過幾款市售產品宣稱有包含酵母。
按一下展開……
 
Peterliu0801 說：
但這要怎麼測…感覺超難的啊…
鹽養鹽跟菌相這兩個怎麼測量啊。
按一下展開……
營養鹽我主要會檢測硝酸鹽和磷酸鹽。
磷酸鹽的話我手邊已經有Hanna HI736了；至於硝酸鹽我平常飼養一直是用Salifert，不過若是實驗用途收數據的話我應該會改用Hanna HI782或是直接買POcean的比色儀。

菌相同樣可以用我們上面一路討論的次世代定序(也就是這整樓所有菌相資料的收集方法)，而樣本來源則可抽取水樣以及沸石表面生物膜的DNA。

Peterliu0801 說：
而且照kz 14天開缸法其實條件很嚴苛耶。
99%現在說kz 開缸的只是用他的菌而已，其他條件幾乎都不成立🤣

貼給你看
www.korallen-zucht.de

Initial cycle - just 14 days? | korallen-zucht.de

www.korallen-zucht.de www.korallen-zucht.de
好文可以收藏🤣，我覺得可以知道蠻多東西的。
但條件很嚴苛需要大量活石。
還有沸石，他的沙等等等….
當然這是要嚴謹的話啦。
按一下展開……
我並不是沒有KZ 14天開缸的經驗，幾年前我也是有用Zeovit 系統養過。
雖然也是有正常養起來，但後來養著養著也就慢慢把所有產品都停掉變回普通的柏林系統了，飼養上也沒因此遇到什麼障礙。
而到現在我也已經很久沒有在缸中使用任何菌種產品了，所以我也才會好奇有沒有那罐菌究竟會差多少。

另外這個實驗設計純粹只是想比較菌種添加是否會有顯著影響而已，重點並不是他們的開缸手法。
原廠本身也有提到這些添加劑產品並沒有限制只能用在Zeovit系統，因此我不認為沒有100%完全照著說明會是很重大的影響因子，而且就像你說的，多數人也不會真的完全照抄。
至於我打算大致照KZ的手法的原因也只是要當一個方便參考和紀錄的reference而已。

Peterliu0801 說：
所以我會覺得這些廠商一定有一些他們的know how。
按一下展開……
I hope so :)
 
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