弧菌感染研究的新發現

[jeremychen]

赤子大的研究精神和對微生物疾病防治的貢獻令人佩服. 小弟也希望能提供一些資訊提供大家參考討論, 但因為看的期刊有限(只有三篇而且都只看介紹和討論xd), 應該會有錯誤請大家更正。我發現也會自己更正.
　　在封閉的環境中，即使持續補充碳源，當細菌繁殖到最大的密度時, 細胞分裂就會被抑制。細菌本身具有特殊的感應能力（quorum-sensing signaling pathway）來偵測族群密度。而此感應能力同時可以調控細菌的感染力(pathogenesis)。當細菌蓬勃繁殖時（log phase）, 感應能力會增強細菌的感染力, 使細菌可以感染魚並大肆繁殖。 但當細菌達到最大的密度時（stationary phase）, 其感應能力反而會抑制細菌的感染力, 目的在於提升細菌在最大密度時的存活率。當感染力被抑制時，細菌可以把能量運用在保護自己，例如產生菌膜抵抗環境中的有害物質如抗生素或酸鹼，或是增強細菌對宿主免疫力的抵抗力(VvpE)。

對於感應能力調控感染力的方法我知道得很少，僅列舉兩點調控機制：1. quorum-sensing會直接調控細菌毒素的生產, 例如cytolysin, hemolysin and RTX. 2. quorum-sensing會調控細胞吸收鐵的能力.鐵對細菌的繁殖和感染能力相當重要, 因為很多參與感染力的蛋白質需要有鐵才有功能。當細菌密度高時，quorum-sensing會抑制細菌吸收鐵的能力，進而抑制分裂和感染能力。　

雖然鐵對細菌的繁殖和感染相當重要，但鐵能載舟亦能覆舟, 過高的鐵會導致有毒物質（自由基）產生而殺死細菌自己,　所以細菌需要有些方法來調控細菌內的鐵含量，Fur就是一種調控鐵含量的蛋白質，另一種會調控鐵濃度的即是quorum-sensing。Fur和quorum-sensing應該是兩種不同的上游管道調控相同的下游途徑（smcR），但在細菌密度大時，quorum-sensing的影響力應該大過Fur。（這部分我不太確定），我自己是認為細菌密度高/ 環境鐵濃度高時，細菌感染力下降主要是因為密度而非鐵濃度。

結論: 我個人認為當細菌的密度過高時，細菌會感應到環境壓力而抑制毒素的產生，並把能量用在保護自己上。短時間內如果魚的抵抗力還撐得住，互許反而不易被感染。但細菌還是可以貼附在魚體上，只是沒有造成疾病。時間久了魚的狀態變差，或是因為細菌的密度下降(因為換到四尺缸)而改變了菌的感染力。所以疾病也就陸續產生生了. 不過我也只是假設罷了.

幫你拍拍手,有你的跟進論壇會更進步,quorum-sensing群感效應也是值得研究的一的議題,在論壇上我很少看到有人會去看文獻後來跟我討論的,科學的發展進程都是先透過觀察>發現問題>思考產生假說>透過實驗形成理論>經由時間大量的實驗數據證實且無法反駁就成為定律

你的文章我會仔細思考的....

 

[jeremychen]

Fur和quorum-sensing也許調控細菌感染力,毒力基因表達的兩大重要因素,所以你的意思是說當細菌偵測到自體誘導物濃度發現族群大到可能會威脅到自己的時候就會開始抑制毒力基因表達嗎?

我覺得細菌要分成兩方面來看,一個是動物體外環境與體內,體外環境就相當於水族箱,偵測的是體外環境族群的數量,但一進入到魚體內很可能就是兩回事了,一般來說魚體內一開始細菌族群都不可能太大,細菌爲了避免被免疫系統偵測到一開始也不會啟動毒力基因的蛋白質來大量分泌毒素,所以根據這個論點我們兩個的假設很有可能會被推翻@@,因為魚體內也是低鐵環境,FUR也會在進入魚體後啟動基因來增強鐵吸收系統....

所以我提出的假設是細菌在體外環境壓力大增時,比方說缺乏資源(碳或鐵)會增強啟動Fur鐵吸收調控系統蛋白基因表達,你說得沒錯鐵離子過多是有毒的,所以fur 蛋白質會依細胞內. 鐵離子濃度來調控鐵離子吸收基因及siderphores 生物合成基因的表現,所以我的假設是當體外環境(魚缸)鐵離子濃度夠高時,可以抑制FUR基因的表達讓細菌毒力大減,當魚身上有傷口或者因任何緊迫原因造成免疫力下降時,可以替魚爭取到一些時間讓免疫系統啟動去抵抗微生物...

當然細菌進入體內時偵測到體內環境是缺鐵的一樣也會啟動FUR基因讓毒力增強來適應環境.我做個比喻好了...

我看過一部電影有關古代戰爭的,一個將領領軍攻城,但久攻不下糧草全部用盡也無後援,於是將領告訴兵士,城裡有酒有肉有女人,城外飢寒受凍的餓死也是早晚的事情,餓死也是一條命,戰死也是一條命,不戰肯定是要餓死沒有退路,戰了也許還有條活路...總之兵士們就豁出去了也打了勝仗....

但如果換個角度,如果當時糧草很足,兵士們真的能視死如歸的攻城?

 

[groundbear]

先謝謝赤子大的鼓勵, 一直受惠您的貢獻, 所以小弟也希望能拋磚引玉. 以下是一點點想法. 小弟不是專家, 也請各位大大指正.

1. 當細菌偵測到自體誘導物濃度發現族群大到可能會威脅到自己的時候就會開始抑制毒力基因表達嗎? 小弟的解讀是:
在弧菌尤其是創傷弧菌和霍亂弧菌的確發現細菌可以偵測族群密度而改變不同virulence factors的產生, 導致對感染力, 抗藥性和細胞毒殺能力改變. virulence factors有很多種, 例如外毒素, 鐵運輸蛋白, 參與在行成菌膜的蛋白, 參與破壞宿主抗體的蛋白, 和運動能力有關的蛋白等等. 當細菌過度生長, 對細胞的毒殺能力反而會下降, 這可能是因為quorum-sensing群感效應抑制外毒素的產生。此時，雖然毒殺細胞的能力下降, 但細菌的"感染潛力"和"抗藥性"反而變強, 因為其他的virulence factors被表現。此時細菌雖然對細胞的殺傷力相對弱, 但長久看來感染的潛力卻很強

2. (您的假設)當體外環境(魚缸)鐵離子濃度夠高時,可以抑制FUR基因的表達讓細菌毒力大減
這點小弟有點不懂. 在鐵缺乏的情況下, Fur的表現量確可能高於鐵充足時的表現量, 但(Fur-iron)的濃度應該是比較低的。調控下游virulence factors是(Fur-iron), 所以當鐵充足(而非過多)的情況下, Fur的表現量雖然下降, 但Fur-iron的濃度應該維持恆定, 此時細菌分泌的外毒素應該會增加(因為Fur-iron會抑制SmcR, 而SmcR會抑制外毒素製造). 但如果鐵的濃度"過高", 因為ROS反而會抑制菌的生長, 所以毒性當然也下降. 我認為實驗要精確調到"適當"而不"過量"的鐵濃度可能很不容易。過量的鐵離子能殺菌也能殺魚, 對此實驗我自己是比較悲觀點. 但我對實驗的直覺好像從來沒準過....XD

3. 您對假設的比喻我了解, 其實一開始我就是被這假設吸引才去看些papers. 我自己認為當糧草充足時, 國家(細菌族群)會不斷徵兵(分裂),並不斷向外擴張(感染).這是細菌的本能(受基因網路調控), 因為細菌比人單純太多, 我不認為細菌會感性的因為環境好就滿足. 但當人(細菌)太多了, 空間變小了,食物不夠了, 環境污染了, 甚至怪獸從南太平洋跑出來了, 此時族群就會節育(抑制分裂), 把錢拿去投資醫療(菌膜), 太空探險(孢子生產), 和鋼彈(防禦), 此時就不會以攻城和礦張為優先了。 所以如果空間允許, 給予充足而不過量的鐵我認為會加重病情. (但只是我猜啦, 純分享討論)

 

[groundbear]

對了, 附上幾篇reference(其實我都只有看introduction和discussion, 所以只知皮毛)
1. The Fur-Iron Complex Modulates the Expression of the Quorum-Sensing Master
Regulator SmcR to Control the Expression of Virulence Factors in Vibrio vulnificus
(全文要付費下載...有需要可以悄悄話)

2. Iron and Quorum Sensing Coordinately Regulate the Expression of Vulnibactin Biosynthesis in Vibrio vulnificus (免費下載)

 

[bbbabab]

弧菌是海洋常在菌,每個人的魚缸都一定有弧菌這是無法避免的,海洋弧菌多半對人類沒致病力,目前好像只有霍亂弧菌才有致病力,而創傷弧菌多半只會感染免疫不全或者肝功能不好的人,如愛滋患者,B肝帶原者,我想我的手常有傷口也常接觸海水,至今沒死應該是具有免疫力吧...

臺灣B肝帶原者數量算多了,如果知道自己是一定要特別注意傷口絕對不能接觸海水,感染創傷弧菌是會送命的...

這問題我好像問你第二次了，太健忘了~~~


我記得洗腎的病人，必須服用碳酸鈣
形成磷酸鈣[Ca3(PO4)2]沈澱，避免吸收過多的磷酸根

養FO，很難避免PO4維持很低的值
在我的缸子裡，Ca沒有消耗的情況下(約400ppm)
PO4的最高值約3~5ppm，就上不去了

而鐵離子也會與PO4形成沈澱(FePO4)
在PO4約3~5ppm的情形下
鐵離子勢必也會有個上限值

 

[jeremychen]

先謝謝赤子大的鼓勵, 一直受惠您的貢獻, 所以小弟也希望能拋磚引玉. 以下是一點點想法. 小弟不是專家, 也請各位大大指正.

1. 當細菌偵測到自體誘導物濃度發現族群大到可能會威脅到自己的時候就會開始抑制毒力基因表達嗎? 小弟的解讀是:
在弧菌尤其是創傷弧菌和霍亂弧菌的確發現細菌可以偵測族群密度而改變不同virulence factors的產生, 導致對感染力, 抗藥性和細胞毒殺能力改變. virulence factors有很多種, 例如外毒素, 鐵運輸蛋白, 參與在行成菌膜的蛋白, 參與破壞宿主抗體的蛋白, 和運動能力有關的蛋白等等. 當細菌過度生長, 對細胞的毒殺能力反而會下降, 這可能是因為quorum-sensing群感效應抑制外毒素的產生。此時，雖然毒殺細胞的能力下降, 但細菌的"感染潛力"和"抗藥性"反而變強, 因為其他的virulence factors被表現。此時細菌雖然對細胞的殺傷力相對弱, 但長久看來感染的潛力卻很強

2. (您的假設)當體外環境(魚缸)鐵離子濃度夠高時,可以抑制FUR基因的表達讓細菌毒力大減
這點小弟有點不懂. 在鐵缺乏的情況下, Fur的表現量確可能高於鐵充足時的表現量, 但(Fur-iron)的濃度應該是比較低的。調控下游virulence factors是(Fur-iron), 所以當鐵充足(而非過多)的情況下, Fur的表現量雖然下降, 但Fur-iron的濃度應該維持恆定, 此時細菌分泌的外毒素應該會增加(因為Fur-iron會抑制SmcR, 而SmcR會抑制外毒素製造). 但如果鐵的濃度"過高", 因為ROS反而會抑制菌的生長, 所以毒性當然也下降. 我認為實驗要精確調到"適當"而不"過量"的鐵濃度可能很不容易。過量的鐵離子能殺菌也能殺魚, 對此實驗我自己是比較悲觀點. 但我對實驗的直覺好像從來沒準過....XD

3. 您對假設的比喻我了解, 其實一開始我就是被這假設吸引才去看些papers. 我自己認為當糧草充足時, 國家(細菌族群)會不斷徵兵(分裂),並不斷向外擴張(感染).這是細菌的本能(受基因網路調控), 因為細菌比人單純太多, 我不認為細菌會感性的因為環境好就滿足. 但當人(細菌)太多了, 空間變小了,食物不夠了, 環境污染了, 甚至怪獸從南太平洋跑出來了, 此時族群就會節育(抑制分裂), 把錢拿去投資醫療(菌膜), 太空探險(孢子生產), 和鋼彈(防禦), 此時就不會以攻城和礦張為優先了。 所以如果空間允許, 給予充足而不過量的鐵我認為會加重病情. (但只是我猜啦, 純分享討論)

我也提供文獻下面這個是南京農業大學實驗室的資料

鐵對嗜水氣單孢菌毒力因子的影響 http://www.docin.com/p-23671718.html

第一個實驗則隨環境中的鐵離子濃度越高,細菌量隨之升高(這不難理解)但毒素,蛋白酶,鐵載體基因表達量卻隨之減少...


臺灣海洋大學

水產養殖動物病原弧菌鐵攝取調控蛋白基因之研究 http://140.121.140.23/cgi-bin/cdrfb3/gsweb.cgi?o=dstdcdr&i=sG0M95330031.id <<可以下載論文全文

這個實驗的FUR比較看不出對應關係,但作白蝦的攻毒試驗可以明顯的發現缺鐵訓化的弧菌致病力較強,死亡率較高..

且以前看到有關石斑的弧菌感染資料統計才發現細菌量不見得等於發病機率,因為該資料發生弧菌感染的月份居然是冬季細菌量最少的時候,然後又根據以上兩個實驗數據我作出一個假設,就是"餓肚子的細菌比較壞"

通常人類會發動戰爭,除了奪取資源外,最重要的也是要奪取空間來領土擴張,因為人類是有史以來利用最短的時間就稱霸地球的生物(人類出現在地球的時間不過萬年而以,卻在數千年以前就稱霸地球),水族箱與實驗室培養基對細菌而言是相對大的空間,細菌並非沒有天敵,小甲殼類生物,原蟲,甚至病毒,或者不同品種的細菌都會發動戰爭,加上蛋白會不斷的把細菌打出去,飼主又會換髒棉或者吸底砂,或者換水,所以對細菌而言如果要對魚類發動戰爭的目的絕非想擴張空間,而是想奪取資源,細菌雖然沒腦,看起來似乎沒有智慧但其生存的動機與策略與高等智慧的人類事實上是沒兩樣...

國富民安當然最有資源發動戰爭,但發動二戰的日本與德國,一個是小島國(空間不足),德國則是一戰時被一堆國家要求巨額的賠款,生活的非常痛苦的歷史背景下發動二戰的...強烈的動機也許比數量來的更重要,比方說目前台灣的少爺兵,就算有兩千萬的部隊叫他上戰場打仗恐怕他們也不願意一戰吧...

我認為細菌與人類沒有兩樣,在空間足夠營養足夠的情況下應該不會窮兵黷武不計代價的想發動戰爭,因為只要打入魚體內就是一個完全缺鐵的環境了,免疫系統也會全力與細菌作戰...在鐵離子足夠的環境下細菌本身奪取鐵的能力會大減,並不適合進入魚體內與免疫系統作戰..

當然實際上會怎樣我也不知道,目前看起來好像沒惡化但也沒好轉,但我餵食量有增大許多了,既然要養肥細菌飼料當然也要餵多點....我的螯合鐵劑量遠大於1ppm南京大學的實驗是超過0.8ppm以上毒素量就不再減低了,糖我只有少量的持續添加,加太多生物膜長的到處都是也不好...也會抑制硝化菌...

小益,其實海洋環境試缺鐵環境,你說得沒錯會很容易沉澱,不管是磷酸根或者氫氧根離子都會造成鐵的沉澱,但我用螯合鐵(EDTA鐵)應該比較不容易沉澱吧...

 

[groundbear]

我也提供文獻下面這個是南京農業大學實驗室的資料

鐵對嗜水氣單孢菌毒力因子的影響 http://www.docin.com/p-23671718.html

第一個實驗則隨環境中的鐵離子濃度越高,細菌量隨之升高(這不難理解)但毒素,蛋白酶,鐵載體基因表達量卻隨之減少...


臺灣海洋大學

水產養殖動物病原弧菌鐵攝取調控蛋白基因之研究 http://140.121.140.23/cgi-bin/cdrfb3/gsweb.cgi?o=dstdcdr&i=sG0M95330031.id <<可以下載論文全文

這個實驗的FUR比較看不出對應關係,但作白蝦的攻毒試驗可以明顯的發現缺鐵訓化的弧菌致病力較強,死亡率較高..

且以前看到有關石斑的弧菌感染資料統計才發現細菌量不見得等於發病機率,因為該資料發生弧菌感染的月份居然是冬季細菌量最少的時候,然後又根據以上兩個實驗數據我作出一個假設,就是"餓肚子的細菌比較壞"

通常人類會發動戰爭,除了奪取資源外,最重要的也是要奪取空間來領土擴張,因為人類是有史以來利用最短的時間就稱霸地球的生物(人類出現在地球的時間不過萬年而以,卻在數千年以前就稱霸地球),水族箱與實驗室培養基對細菌而言是相對大的空間,細菌並非沒有天敵,小甲殼類生物,原蟲,甚至病毒,或者不同品種的細菌都會發動戰爭,加上蛋白會不斷的把細菌打出去,飼主又會換髒棉或者吸底砂,或者換水,所以對細菌而言如果要對魚類發動戰爭的目的絕非想擴張空間,而是想奪取資源,細菌雖然沒腦,看起來似乎沒有智慧但其生存的動機與策略與高等智慧的人類事實上是沒兩樣...

國富民安當然最有資源發動戰爭,但發動二戰的日本與德國,一個是小島國(空間不足),德國則是一戰時被一堆國家要求巨額的賠款,生活的非常痛苦的歷史背景下發動二戰的...強烈的動機也許比數量來的更重要,比方說目前台灣的少爺兵,就算有兩千萬的部隊叫他上戰場打仗恐怕他們也不願意一戰吧...

我認為細菌與人類沒有兩樣,在空間足夠營養足夠的情況下應該不會窮兵黷武不計代價的想發動戰爭,因為只要打入魚體內就是一個完全缺鐵的環境了,免疫系統也會全力與細菌作戰...在鐵離子足夠的環境下細菌本身奪取鐵的能力會大減,並不適合進入魚體內與免疫系統作戰..

當然實際上會怎樣我也不知道,目前看起來好像沒惡化但也沒好轉,但我餵食量有增大許多了,既然要養肥細菌飼料當然也要餵多點....我的螯合鐵劑量遠大於1ppm南京大學的實驗是超過0.8ppm以上毒素量就不再減低了,糖我只有少量的持續添加,加太多生物膜長的到處都是也不好...也會抑制硝化菌...

小益,其實海洋環境試缺鐵環境,你說得沒錯會很容易沉澱,不管是磷酸根或者氫氧根離子都會造成鐵的沉澱,但我用螯合鐵(EDTA鐵)應該比較不容易沉澱吧...

ok 謝謝指導. 兩篇文章都顯示在限鐵濃度條件下(約10-100)uM的確對細胞或蝦的毒殺能力有降低. 如果要實際測試此鐵濃度下, 菌對魚的毒性的確可以嘗試(第一篇是細胞，第二篇就是測試蝦, 所以測試魚的確有意義). 這部分我之前想的可能是錯的XD。或許給予10-100uM鐵可以減緩環境中細菌引起病情的時間. 不過對於已經被感染的魚可能又是不同的故事...

實驗上,可以先用個小容器養好菌, 再加等量菌液到不同小魚缸, 每個小魚缸含有不同的鐵濃度(例如0, 10, 100uM), 和相同種類大小和數量的魚, 再比較感染狀況。

 

[jeremychen]

ok 謝謝指導. 兩篇文章都顯示在限鐵濃度條件下(約10-100)uM的確對細胞或蝦的毒殺能力有降低. 如果要實際測試此鐵濃度下, 菌對魚的毒性的確可以嘗試(第一篇是細胞，第二篇就是測試蝦, 所以測試魚的確有意義). 這部分我之前想的可能是錯的XD。或許給予10-100uM鐵可以減緩環境中細菌引起病情的時間. 不過對於已經被感染的魚可能又是不同的故事...

實驗上,可以先用個小容器養好菌, 再加等量菌液到不同小魚缸, 每個小魚缸含有不同的鐵濃度(例如0, 10, 100uM), 和相同種類大小和數量的魚, 再比較感染狀況。

其實這很難說是對錯,關於以經受感染的魚提升外界鐵離子濃度是肯定沒效的,因為細菌的世代非常短,一進入魚體偵測到鐵離子很低也可以在短時間內啟動基因表現來適應環境,我只是想看看這種環境對還沒受感染的魚有沒有預防的效果,但我沒實驗室能作細菌純化攻毒試驗@@,只能作很簡單的實驗而以...

 

[tamasi666]

在有限的條件,要找到無限大的因素,各位大大們真的很有實驗精神,讓小弟我不得敬佩,
就各位大大上訴之結果,要抑制細菌毒素,方法有其二,
其一為是讓細菌之數量達到一定之上限,且維持其平衡,使其相互牽制,這樣細菌們就不會做亂,(這個就個人的解讀,比較難掌握)
其二,製造一個對於細菌來說是一個優渥的環境,這樣他們吃飽喝足之後就不會作怪了
這是小弟讀完各位大大的文章之後的解讀,如有錯誤,還請指教!!!
謝謝