Peterliu0801 說：

有實驗跟文章還是讚啊～
反正在這個資訊爆炸的年代，要怎麼萃取精華跟納為己用本來就是現代人需要學習的。

之前會懷疑主要是離心的方式應該都把東西旋死了，裡面除了DNA應該還會包含一些副產物吧。

按一下展開……

抽取DNA的過程本來就要把細胞打破，所以死活其實根本沒差，不用像取活菌那樣還要特別小心離心不能傷到菌。

而抽DNA的目的基本上就是要盡量去除樣本裡DNA以外的東西。
目前我這邊做完的步驟是先用市售的extraction kit來沉澱以及吸附掉蛋白質等雜質進行初步的純化，然後用UV測吸光度量濃度和純度。
接下來我會再把這些DNA做PCR擴增要進行定序的片段後拿去跑膠體電泳做第二次純化。
電泳的原理是把DNA打到洋菜膠體裡後通電，然後靠DNA帶負電的特性分離不同長度的片段(越長往正極跑得越慢)，最終把目標片段從洋菜膠中切出來就完成純化了。
這樣的膠體純化會進行兩次，同時中間會再幫每個樣本的DNA裝上不同的辨識用序列(分析定序結果時才認得出該DNA屬於哪個樣本)，最終的成品就可以準備送去定序公司了。

jeremie 說：

抽取DNA的過程本來就要把細胞打破，所以死活其實根本沒差，不用像取活菌那樣還要特別小心離心不能傷到菌。

而抽DNA的目的基本上就是要盡量去除樣本裡DNA以外的東西。
目前我這邊做完的步驟是先用市售的extraction kit來沉澱以及吸附掉蛋白質等雜質進行初步的純化，然後用UV測吸光度量濃度和純度。
接下來我會再把這些DNA做PCR擴增要進行定序的片段後拿去跑膠體電泳做第二次純化。
電泳的原理是把DNA打到洋菜膠體裡後通電，然後靠DNA帶負電的特性分離不同長度的片段(越長往正極跑得越慢)，最終把目標片段從洋菜膠中切出來就完成純化了。
這樣的膠體純化會進行兩次，同時中間會再幫每個樣本的DNA裝上不同的辨識用序列(分析定序結果時才認得出該DNA屬於哪個樣本)，最終的成品就可以準備送去定序公司了。

按一下展開……

大概大概了解啊～
簡單說就是要加入變性劑？還什麼的去分層取出DNA, 再切成片段去定序。（印象中一次性能讀取的長度一直有在進步？）
但這種DNA 純化方法據我所知的產生出來的副產物本來就也會比較多。（脂質、蛋白質等等等）
畢竟後續還會再加工才去定序。

回歸主題：
感覺用這個DNA萃取菌種大小觀察菌數可能誤差會比較大～
若要看菌數占比（%），也許正規的方式比較好？
這麼純的學術討論也是蠻有趣的。看能不能從中歸納出方法。不然現在也是處在一個好用繼續用的階段。也不知道作用上是怎麼作用。個廠牌間擅長的部分是什麼及各種優缺點。真希望有開天眼的那一天～

Peterliu0801 說：

大概大概了解啊～
簡單說就是要加入變性劑？還什麼的去分層取出DNA, 再切成片段去定序。（印象中一次性能讀取的長度一直有在進步？）
但這種DNA 純化方法據我所知的產生出來的副產物本來就也會比較多。（脂質、蛋白質等等等）
畢竟後續還會再加工才去定序。

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基本上除了定序本身是花錢給別人弄外外其他的樣本前處理都是我們實驗室內會自己弄。

做菌相分析的樣本處理流程簡化後大概是這樣：
1. 初步萃取DNA(主要靠鹽類和酒精洗掉其他東西)
2. PCR把萃取完的DNA中目標片段擴增
3. 跑電泳分離PCR產物後切膠純化(到這裏基本上已經不太會有DNA外的東西了)
4. 再次透過PCR擴增上一步產物順便裝上辨識用的序列
5. 再跑電泳切膠純化一次

如果是要分析菌相的話通常只會單純看16S rRNA 的DNA片段，所以PCR擴增的就是這區，至於其他DNA就會在切膠純化時分離掉，最終交給定序公司的就是一堆乾淨的16S序列讓他們來讀。
16S是原核生物共有的基因，雖然結構差不多但序列的變異性又足夠用來區分不同微生物，因此有很充足的資料庫可以比對定序出來的東西到底是啥。

Peterliu0801 說：

感覺用這個DNA萃取菌種大小觀察菌數可能誤差會比較大～
若要看菌數占比（%），也許正規的方式比較好？
這麼純的學術討論也是蠻有趣的。看能不能從中歸納出方法。不然現在也是處在一個好用繼續用的階段。也不知道作用上是怎麼作用。個廠牌間擅長的部分是什麼及各種優缺點。真希望有開天眼的那一天～

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如果單純只是抽出來濃度差很多的話我大概也不會想太多，畢竟會造成萃取結果不同的原因還有其他。但這次連菌塊大小靠肉眼就已經看得出明顯差異了，其DNA濃度差我自然也會認為大概率是源自於根本上的菌量不同。

真的要靠分子生物技術定量的話還有個方法是qPCR(就是之前疫情時新聞常出現那個)，只是我們這裡沒有設備就是了。
不過我的目標還是先以菌相為主，至少看看裡頭到底理應是些什麼東西吧。

身為水產養殖系畢業 玩珊瑚又從事水產養殖業的我來看
我相信生命科學相關畢業的人都很清楚
微生物操作是一件非常嚴謹的事情
培養及操作都是需要在無菌操作台去避免受到汙染
所以面對市售液體水族用菌
我都頗嗤之以鼻，在富含營養的培養夜裏面添加各式活菌，要如何避免汙染?
還有要如何保證在有效期限內不讓保持菌株數的平衡?
但為何在水產養殖用菌上幾乎90%都是以菌粉模式去銷售
為的就是減少菌汙染的狀況且更加安全
最後kz系統就是以異營菌控Np系統
類似於水產養殖的biofloc 系統，我們會在水中添加砂糖或是糖蜜以增加異營菌的數量
進而減少飼料所產生的含氮廢棄物，
靠硝化菌的系統通常效率不佳。

macintosh612 說：

身為水產養殖系畢業 玩珊瑚又從事水產養殖業的我來看
我相信生命科學相關畢業的人都很清楚
微生物操作是一件非常嚴謹的事情
培養及操作都是需要在無菌操作台去避免受到汙染
所以面對市售液體水族用菌
我都頗嗤之以鼻，在富含營養的培養夜裏面添加各式活菌，要如何避免汙染?

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然而水產養殖跟海水缸, 特別是養珊瑚的缸子還是有很大區別的.
水產養殖的那些菌粉.(枯草菌阿等等等, 而且味道也不好聞) 沒辦法把營養鹽的level降到足夠低.
所以我覺得是沒辦法概括而論啦~水產養殖只是把水質調整到可以養水產的等級.
不然我相信大家都拿水產養殖的菌來開缸就好了啊 一袋沒多少錢~省錢又厲害的話, 市面上這些品牌菌不就不用玩了.
不過你是專家的話可以來釋疑一下.

macintosh612 說：

還有要如何保證在有效期限內不讓保持菌株數的平衡?
但為何在水產養殖用菌上幾乎90%都是以菌粉模式去銷售
為的就是減少菌汙染的狀況且更加安全

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菌粉沒記錯8.4有舊的文章討論過. 相對效果應該是更差的.(對珊瑚缸來說, np跟營養鹽較要求的情況)
有用的還是異營菌阿. 所以才要一直補.(沒辦法長久生存)

macintosh612 說：

最後kz系統就是以異營菌控Np系統

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認同, 如上所說其實市面上應該都是異營菌吧. 才能有效控制NP. 過外論壇很多都有討論到.

macintosh612 說：

類似於水產養殖的biofloc 系統，我們會在水中添加砂糖或是糖蜜以增加異營菌的數量
進而減少飼料所產生的含氮廢棄物，
靠硝化菌的系統通常效率不佳。

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